기본적으로 모든 주문건에 대해서 Polyacrylamide gel electrophoresis로 품질관리를 실시하고 있습니다.
50 mer 이하의 제품에 대해서는 MALDI-TOF/MS에 의한 질량 분석을 실시하고 있습니다.
Oligonucleotide는 일반적으로 건조된 상태로 공급됩니다. 이것은 운송과정에서 노출될 수 있는 여러가지 환경적 요인으로 인한 oligo의 변성을 방지하기 위함입니다. 건조된 oligo는 때때로 용기 개봉 과정에서 손실될 수 있으니 잠시 원심분리한 후 개봉하시기 바랍니다. 특히 latex 장갑 등 정전기를 일으키는 착용물을 끼고 뚜껑을 개봉하면 건조된 oligo powder가 손실될 위험성이 높으니 특히 주의를 요합니다. Oligo 제품을 수령하신 후 용기에 기재된 양의 TE buffer (10 mM Tri-HCl pH8.0, 1 mM EDTA) 또는 멸균증류수에 녹여 100 uM stock 상태로 -20℃이하에 보관하시고, 사용시 적정 농도로 희석하여 사용하시기를 권장합니다. 수용액 상태에서 oligo는 멸균증류수보다 TE buffer가 안정하기는 하나 경우에 따라서 TE buffer 조성이 반응에 영향을 미칠 수 있으니 주의바랍니다. 수용액 상태의 Oligo를 반복적으로 동결/해동할 경우 변성될 위험성이 있으니 소량 분주하여 사용하시기를 권장합니다.
당사에서는 99 mer까지를 합성 한계로 정하고 있습니다. 그 이상의 길이를 의뢰하실 경우는 당사에 문의해 주시기 바랍니다.
Oligo 합성에 사용되는 Column내 CPG (controlled pore glass)의 양에 따라 합성되는 oligo의 합성수율은 달라집니다. 예를 들어 0.05 µmole 스케일로 주문 하실 경우, 3'base가 최소 0.05 µmole 이상 coupling 될 수 있는 양의 CPG가 충진된 column을 사용합니다. 이후 합성과정에서 매 cycle 다음 염기가 coupling 되지 못한 0~2%를 배제시키는 capping 과정에서 손실이 발생하고, 그 다음 정제공정상에서도 손실이 발생합니다. 따라서 0.05 µmole 스케일이란 합성 시 시작량을 의미하기 때문에 최종 양과 차이가 있을 수 있습니다. 또한 0.2 µmole 스케일 주문시 0.05 µmole 스케일로 주문하셨을 때와 최종 양이 반드시 비례 증가되진 않습니다.
Oligo size, coupling efficiency, base composition, 정제방법 등으로 인해 합성 수율은 달라집니다.
동일한 oligo를 합성한다해도 합성과정과 정제과정에서의 여러 가지 요인들로 인해 oligo의 합성 수율은 차이가 나게 됩니다.
Oligo의 50%가 그 상보서열에 결합해 있을 때의 온도를 의미하며, 이는 절대값이 아니고 농도 및 수용액상의 salt 농도 등에 따라 달라집니다.
Tm 값의 계산식은 여러 가지 종류가 있어 채용하는 계산식에 따라 값이 다릅니다. 간혹 고객님께서 사용하시는 계산식 program에 따라 당사의 계산과 다른 결과가 나오기도 합니다.
당사에서 사용하는 Tm calculator는 일반적으로 염기 개수에 일정 값을 곱하는 단순 계산식이 아닌, 염기 조성뿐만아니라 배열 순서에 따라 Tm 값이 달라지는 점을 고려하여 다음 계산식을 채택하고 있습니다. Tm 값은 이론적으로 계산된 값이기 때문에 실제 실험결과와 일치하지는 않습니다. 따라서 PCR 등에 oligo 사용시 실험적으로 최적 온도 적정이 필요합니다.
* 17 mer 이하 :
４×（G+C+R/2+Y/2+M/2+S+K/2+D/3+H/3+2B/3+2V/3+N/2）＋２×
（A+T+R/2+Y/2+M/2+W+K/2+2D/3+2H/3+B/3+V/3+N/2+I+U）
* 18 mer 이상 :
60.8＋41×{（G+C+R/2+Y/2+M/2+S+K/2+D/3+H/3+2B/3+2V/3+N/2）/염기수}－（500/염기수）
* Salt 농도 조건
0.0567（M）＝0.05（KCl 농도）＋0.01×0.67（Tris 농도)
50 mM KCl농도
10 mM Tris-HCl 농도(pH8.4-9.0 at 25℃)
OPC (Oligonucleotide Purification Cartridge) 정제는 간이 컬럼 정제라고도 하며, 역상크로마토그래피 (reverse-phase chromatography) resin, Oligo R3가 충진된 column을 사용합니다. 합성이 끝난 Oligo는 정상적인 합성이 완료된 것과 coupling을 이루지 못해 capping된 불완전 산물이 혼합되어 있습니다.
합성 마지막 단계에서 DMT기가 결합된 정상적으로 합성이 완료된 oligo는 DMT기의 소수성으로 OPC resin에 결합하게 되고 나머지 불완전한 산물 및 부산물들은 column을 통과해서 빠져나갑니다. 그 다음 oligo에서 DMT기를 떼어내는 과정을 통하여 resin으로부터 oligo를 회수하게 됩니다.
50 mer 이상의 긴 oligo 합성시 고순도 oligo를 필요로 할 때 PAGE정제를 시행합니다. OPC 정제 산물을 PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)로 전개하여 주밴드만 분리하는 정제법으로 90% 이상의 고순도 oligo를 확보할 수 있습니다. 정제 과정에서 손실이 많아 최종 수득량이 다소 적을 수 있습니다.
50 mer 이하의 oligo 합성시 고순도 oligo를 필요로 할 때 RP-HPLC (Reverse-phase HPLC) 정제를 시행합니다. 기본 원리는 OPC와 유사하나, HPLC column을 사용하기 때문에 높은 분리능으로 90% 이상의 고순도 oligo를 확보할 수 있습니다. 특히 형광이 표지된 oligo 합성시 반드시 필요한 정제 공정입니다. 정제 과정상의 손실로 최종 수득량이 다소 적을 수 있습니다.
Oligo 합성 과정에서는 매 cycle당 약 0~2%는 coupling반응이 일어나지 않아 capping으로 제거됩니다. 따라서, oligo 길이가 길어지면 그만큼 합성 실패 percentage가 증가하게 됩니다. 99% 효율일 때 정상의 oligo와 잘못된 oligo의 혼합비율은 아래표와 같습니다.
Percentage Yield of Full-length and Failed Oligo by Length
| Length(no. of bases) |
Product |
Failure |
| 10 |
91 |
9 |
| 20 |
83 |
17 |
| 50 |
61 |
39 |
| 75 |
48 |
52 |
| 100 |
37 |
63 |
참고로 표에서는 전체 합성효율에 영향을 미칠 수 있는 다른 화학적 요소를 배제한 것으로, 대표적으로 purine계 염기 (특히 'A')에서 base가 떨어져 나가는 "depurination" 현상입니다.
Depurination된 염기는 deprotection 단계에서 보통 제거되며 이를 "X elimination" 이라 합니다. Depurination의 비율은 매우 낮으나 올리고 길이에 따라 크게 늘어납니다.
G가 4개이상 반복되면 guanine tetraplex 형태로 aggregation 될 수 있기 때문에 합성에 어려움이 있습니다. G가 반복되는 oligo 합성시 PAGE 및 HPLC가 어려운 문제가 있기 때문에 OPC 정제를 권장합니다.
