두 시스템의 가장 큰 차이점은 target sequence를 인식하는 방식입니다.
CRISPR : 20 nucleotide target sequence와 동일한 single guide RNA (sgRNA)를 사용합니다. Target sequence는 Protospacer Adjacent Motif (PAM)으로 알려진 3 nucleotide (5’-NGG-3’) 바로 뒤에 존재해야 하며, sgRNA는 원하는 site로 Cas9 nuclease를 guide하게 됩니다. CRISPR system을 사용할 경우에는 sgRNA sequence를 디자인해야 합니다.
Figure Mechanism of CRISPR-Cas9:sgRNA target recognition and cleavage
TALE : 연속적으로 이어진 34개의 amino acids로 구성된 repeats 내의 variable amino acid를 사용하여 target sequence를 인식할 수 있는 단백질입니다. 이러한 variant amino acids를 Repeat Variable Diresidues (RVDs)라고 합니다. 각각의 repeat는 1 RVD를 포함하며 각각의 RVDs는 1개의 특이적 nucleotide (A, T, G, C)를 인식할 수 있습니다.
TALE은 nuclease 또는 transcriptional modulator 등의 genome editing motifs와 fusion되어 있습니다. TALE 기반의 system을 사용할 경우에는 target sequence를 정확히 인식할 수 있는 순서로 RVDs를 조립해야 합니다.
Figure Top : Schematic representation of a TAL effector. Bottom : RVD recognition code
GeneCopoeia의 TALEN 및 CRISPR sgRNA는 유전자의 coding region 앞쪽 부분을 targeting하여 설계됩니다.
이는 해당 유전자로부터 이미 알려지거나 예측되는 모든 transcript variants까지 효과적으로 Knock-out할 수 있는 디자인입니다.